lunes, 30 de noviembre de 2009
lunes, 23 de noviembre de 2009
Conocimientos de Genética Básica (kindergarden) 2
Para los que se quedaron con las ganas de mas (siiii, másss mássss) he aqui otro divertido (y educativo) test para reafirmar los conocimientos de su epoca de estudiante. Si esta mal, favor de reportarlo con las autoridades competentes.. en este caso, yo no soy su mejor opción. Qué lo disfrute!! Si señor!
1. ¿Cita algún ejemplo en que el uso de marcadores para cromosoma Y dé mayor ventaja respecto a los marcadores nucleares empleados en el área forense? Respalda tu respuesta con su respectivo argumento.
Los marcadores más interesantes a efectos forense son los microsátelites, aunque los marcadores bialélicos (mayormente SNPs) están empezando a tener una gran importancia por su sensiblilidad para poder ser analizados en miuestras mininas y po la posibilidad de definir con presicipion el haplotipo y poder asi dar datos sobre el origen geográfico posible de una muestra.
Un pequeño porcentaje del ADN nuclear conforma lo que podemos denominar el ADN sexual, determinante del sexo. El componente masculino del ADN sexual, sólo presente en varones, es el cromosoma "Y". Existen marcadores específicos capaces de poner en evidencia un patrón genético limitado a este cromosoma, conocido como "haplotipo Y", que presenta las siguientes características:
a) es propio de cada individuo.
b) Se transmite de padres a hijos sin sufrir modificaciones, por lo que los miembros masculinos de una familia compartirán el mismo haplotipo.
La capacidad identificatoria que estas propiedades le confieren hacen que la investigación del "haplotipo Y" constituya una técnica adicional entre los métodos de individualización forense, particularmente útil en la investigación de delitos sexuales y para reforzar la pertenencia a un determinado grupo familiar.
La aplicación de esta técnica al estudio de hechos de violación, se basa en la eficiencia que, en ocasiones, ha demostrado el análisis del componente masculino (cromosoma "Y") en las muestras mezcladas, compuestas éstas por la presencia de material proveniente del victimario y de la víctima tanto femenina como masculina.
Cuando la víctima es de sexo femenino, el material genético masculino, si es muy escaso, puede no ser puesto en evidencia por la interferencia del material genético femenino claramente predominante.
Ello puede no ocurrir con el "haplotipo Y", que se puede manifestar aún en presencia de abundante material femenino. Esta característica resulta todavía más valiosa en el caso de violaciones con perpetradores múltiples.
En los casos en los que la víctima pertenece al sexo masculino, el "haplotipo Y" del victimario que pudiera estar presente en la evidencia, puede inferirse por sus diferencias con el "haplotipo Y" de la víctima.
Si el niño y los familiares pertenecen al sexo masculino y no se cuenta con el perfil genético del padre, el empleo del "haplotipo Y" brindará información complementaria, especialmente valiosa para el dictamen de exclusión, dado que si el titular no pertenece a ese grupo familiar podrá presentar un "haplotipo Y" diferente al de los varones de la familia que comparten un linaje paterno.
Si bien no cabe duda sobre los beneficios que esta técnica puede brindar en situaciones como las descriptas, la limitación del método reside en las dificultades de interpretación de los dictámenes de no exclusión, generadas por el hecho de presentar todos los familiares de un padre alegado o de un sospechoso, aún los más alejados, el mismo haplotipo. Por el contrario, los dictámenes de exclusión son definitorios.
2. ¿Cita algún ejemplo en que el uso de DNA mitocondrial dé mayor ventaja respecto a los marcadores nucleares empleados en el área forense?
Respalda tu respuesta con su respectivo argumento.
*3. ¿Cita algún ejemplo en que el uso de marcadores SNPs dé mayor ventaja respecto a otros marcadores nucleares empleados en el área forense? Respalda tu respuesta con su respectivo argumento.
4. ¿Define qué es un polimorfismo?
5. Uno de los primeros casos de heteroplasmia fue el que se encontró el DNA mitocondrial de los restos del Zar Nicolás II. Ahora bien ¿qué es la heteroplasmia?
6. En el caso de violación de una mujer, la victima revela que su ataque se desarrolló en la oscuridad y al interior de su casa e indica que su probable agresor sea uno de sus hermanos pues cree haberle reconocido por las ropas. Revela también, que cuenta con otros familiares varones, tíos y primos por vía paterna en edades oscilantes al hermano que supone la ha violado. Se sabe además que todos viven en el mismo domicilio. El Juez del caso sabe de las virtudes de los marcadores para cromosoma “Y” luego de ver la mitad de un capitulo de CSI, así que ordena se practique su análisis en las muestras procedentes de esta violación. Sin embargo, se pide su opinión. ¿A todo esto usted qué le responde?
*7. Guadalupe Rodríguez Peña alías “Lupe la sabrosa Rodríguez” quien es conocida en Iztapalapa por sus ricos tamales verdes, de mole y de dulce, es acusada de asesinato luego de que un comensal de sus ricos tamales denunciara la presencia de un dedo gordo de un pie en uno de los tales verdes durante su desayuno. Luego de la noticia y casi inmediatamente, cinco vecinas de su domicilio dan conocimiento de la desaparición sus maridos. Durante el peritaje, sólo se encuentran diez tamales de dulce y un tamal de mole con media oreja al interior, por lo demás no hay ningún otro indicio biológico. Dedo gordo y media oreja son llevados al laboratorio de Genética Forense en el cual usted trabaja.
Algunos días después, el Procurador le pide responda los cuestionamientos que los medios informativos de forma incisiva le han generado. Entre las preguntas se encuentran las siguientes: ¿Qué tipo de marcadores moleculares serán empleados para saber si las muestras halladas corresponden a los desaparecidos? y ¿cuáles son los criterios por los cuales han sido elegidos tales marcadores?
8. ¿Cuál es la razón por la cual el DNA mitocondrial puede hallarse aún en restos óseos y muestras degradadas?
* 9. ¿Por qué cree usted que sea mayormente empleado el uso de la lisis diferencial en muestras biológicas procedentes de casos de violación cuando se cuenta con marcadores como cromosoma Y?
*10. ¿Por qué crees que se empleen diferentes fluorocromos (marcas fluorescentes de diferente color) en los marcadores de tipo STRs?
1. ¿Cita algún ejemplo en que el uso de marcadores para cromosoma Y dé mayor ventaja respecto a los marcadores nucleares empleados en el área forense? Respalda tu respuesta con su respectivo argumento.
Los marcadores más interesantes a efectos forense son los microsátelites, aunque los marcadores bialélicos (mayormente SNPs) están empezando a tener una gran importancia por su sensiblilidad para poder ser analizados en miuestras mininas y po la posibilidad de definir con presicipion el haplotipo y poder asi dar datos sobre el origen geográfico posible de una muestra.
Un pequeño porcentaje del ADN nuclear conforma lo que podemos denominar el ADN sexual, determinante del sexo. El componente masculino del ADN sexual, sólo presente en varones, es el cromosoma "Y". Existen marcadores específicos capaces de poner en evidencia un patrón genético limitado a este cromosoma, conocido como "haplotipo Y", que presenta las siguientes características:
a) es propio de cada individuo.
b) Se transmite de padres a hijos sin sufrir modificaciones, por lo que los miembros masculinos de una familia compartirán el mismo haplotipo.
La capacidad identificatoria que estas propiedades le confieren hacen que la investigación del "haplotipo Y" constituya una técnica adicional entre los métodos de individualización forense, particularmente útil en la investigación de delitos sexuales y para reforzar la pertenencia a un determinado grupo familiar.
La aplicación de esta técnica al estudio de hechos de violación, se basa en la eficiencia que, en ocasiones, ha demostrado el análisis del componente masculino (cromosoma "Y") en las muestras mezcladas, compuestas éstas por la presencia de material proveniente del victimario y de la víctima tanto femenina como masculina.
Cuando la víctima es de sexo femenino, el material genético masculino, si es muy escaso, puede no ser puesto en evidencia por la interferencia del material genético femenino claramente predominante.
Ello puede no ocurrir con el "haplotipo Y", que se puede manifestar aún en presencia de abundante material femenino. Esta característica resulta todavía más valiosa en el caso de violaciones con perpetradores múltiples.
En los casos en los que la víctima pertenece al sexo masculino, el "haplotipo Y" del victimario que pudiera estar presente en la evidencia, puede inferirse por sus diferencias con el "haplotipo Y" de la víctima.
Si el niño y los familiares pertenecen al sexo masculino y no se cuenta con el perfil genético del padre, el empleo del "haplotipo Y" brindará información complementaria, especialmente valiosa para el dictamen de exclusión, dado que si el titular no pertenece a ese grupo familiar podrá presentar un "haplotipo Y" diferente al de los varones de la familia que comparten un linaje paterno.
Si bien no cabe duda sobre los beneficios que esta técnica puede brindar en situaciones como las descriptas, la limitación del método reside en las dificultades de interpretación de los dictámenes de no exclusión, generadas por el hecho de presentar todos los familiares de un padre alegado o de un sospechoso, aún los más alejados, el mismo haplotipo. Por el contrario, los dictámenes de exclusión son definitorios.
2. ¿Cita algún ejemplo en que el uso de DNA mitocondrial dé mayor ventaja respecto a los marcadores nucleares empleados en el área forense?
Respalda tu respuesta con su respectivo argumento.
*3. ¿Cita algún ejemplo en que el uso de marcadores SNPs dé mayor ventaja respecto a otros marcadores nucleares empleados en el área forense? Respalda tu respuesta con su respectivo argumento.
4. ¿Define qué es un polimorfismo?
5. Uno de los primeros casos de heteroplasmia fue el que se encontró el DNA mitocondrial de los restos del Zar Nicolás II. Ahora bien ¿qué es la heteroplasmia?
6. En el caso de violación de una mujer, la victima revela que su ataque se desarrolló en la oscuridad y al interior de su casa e indica que su probable agresor sea uno de sus hermanos pues cree haberle reconocido por las ropas. Revela también, que cuenta con otros familiares varones, tíos y primos por vía paterna en edades oscilantes al hermano que supone la ha violado. Se sabe además que todos viven en el mismo domicilio. El Juez del caso sabe de las virtudes de los marcadores para cromosoma “Y” luego de ver la mitad de un capitulo de CSI, así que ordena se practique su análisis en las muestras procedentes de esta violación. Sin embargo, se pide su opinión. ¿A todo esto usted qué le responde?
*7. Guadalupe Rodríguez Peña alías “Lupe la sabrosa Rodríguez” quien es conocida en Iztapalapa por sus ricos tamales verdes, de mole y de dulce, es acusada de asesinato luego de que un comensal de sus ricos tamales denunciara la presencia de un dedo gordo de un pie en uno de los tales verdes durante su desayuno. Luego de la noticia y casi inmediatamente, cinco vecinas de su domicilio dan conocimiento de la desaparición sus maridos. Durante el peritaje, sólo se encuentran diez tamales de dulce y un tamal de mole con media oreja al interior, por lo demás no hay ningún otro indicio biológico. Dedo gordo y media oreja son llevados al laboratorio de Genética Forense en el cual usted trabaja.
Algunos días después, el Procurador le pide responda los cuestionamientos que los medios informativos de forma incisiva le han generado. Entre las preguntas se encuentran las siguientes: ¿Qué tipo de marcadores moleculares serán empleados para saber si las muestras halladas corresponden a los desaparecidos? y ¿cuáles son los criterios por los cuales han sido elegidos tales marcadores?
8. ¿Cuál es la razón por la cual el DNA mitocondrial puede hallarse aún en restos óseos y muestras degradadas?
* 9. ¿Por qué cree usted que sea mayormente empleado el uso de la lisis diferencial en muestras biológicas procedentes de casos de violación cuando se cuenta con marcadores como cromosoma Y?
*10. ¿Por qué crees que se empleen diferentes fluorocromos (marcas fluorescentes de diferente color) en los marcadores de tipo STRs?
Compruebe sus conocimientos en Genetica
...resolviendo este sencillo (y feliz) test de Bioquímica. Es mejor que los crucigramas en el periodico!!
1. Son marcadores moleculares caracterizados por ser bialélicos y que se denominan de un sólo nucleótido:
a) RFLPs
b) VNTRs
c) SNPs
d) STRs
e) Ninguno de los anteriores
f) Todos los anteriores
2. Son los marcadores moleculares que requieren del empleo de enzimas de restricción:
a) RFLPs
b) VNTRs
c) SNPs
d) STRs
e) Ninguno de los anteriores
f) Todos los anteriores
3. Son marcadores moleculares caracterizados por encontrarse en sucesiones repetidas (tándem) de 2 a 7 nucleótidos
a) RFLPs
b) VNTRs
c) SNPs
d) STRs
e) Ninguno de los anteriores
f) Todos los anteriores
4. Son los marcadores más adecuados cuando se trata de muestras muy degradadas:
a) RFLPs
b) VNTRs
c) SNPs
d) STRs
e) Ninguno de los anteriores
f) Todos los anteriores
En los últimos tiempos, se ha incorporado a la Genética Forense una técnica complementaria a los STRs, los llamados marcadores SNPs (Single Nucleotid Polimorphisme), que permiten obtener ADN de muestras muy degradadas o muy pequeñas ─es posible incluso extraer el ADN de algunas huellas dactilares latentes─, e incrementan las posibilidades informativas ─estudio del origen geográfico, por ejemplo. En la actualidad, los STRs siguen siendo los marcadores más empleados, y los SNPs se utilizan, ante todo, para muestras muy degradadas.
5. Su empleo puede aplicarse al DNA nuclear:
a) RFLPs
b) VNTRs
c) SNPs
d) STRs
e) Ninguno de los anteriores
f) Todos los anteriores
ForenseRFLPs
•Enzimas de restricción reconocen secuencias de DNA específico.
•Cualquier cambio en la secuencia del DNA crea o elimina sitios de restricción particulares.
•Alterando el tamaño de uno o más fragmentos del DNA (Southern blot).
•Población no tienen los mismos sitios de restricción
6. Para qué sirven y cuáles son las características que hacen a las tarjetas FTA uno de los materiales de mayor uso en los laboratorios de Genética Forense.
Es una herramienta revolucionaria para simplificar la recolección, archivado, purificación y análisis de DNA y RNA obtenidos de un amplio surtido de fuentes biológicas, tales como sangre total, raspados bucales, materiales de planta, plásmicos, tejido y microorganismos.
Ventajas: No hay fractura de DNA, purificación simple, fácil almacenamiento.
Duración de la muestra: Hasta -81°C seis meses. Temperatura ambiente y humedad de 6 meses sin protección. Temperatura ambiente y humedad 11 años con protección.
Aplicación: Aislamiento de ADN Genómico; aislamiento de ADN mitocondrial, aislamiento de ADN proviral.
8. Explica con detalle en qué consiste y cómo se realiza una extracción con Chelex.
El Chelex es un compuesto de copolimeros de estireno divinilbenceno, que contiene iones inminodiacetato apareados, los cuales actúan como quelantes, agrupando los iones metálicos polivalentes como el magnesio, agrupando los iones metálicos polivalentes como el magnesio. El retido de magnesio en la reacción inhibe a las enzmas , muy útil en ciencia forense, porque en concentraciones de 5 al 10% de Cheles-100 es capaz de depurar suficientemente la gran mayoría de las muestras, dejándolas aptas para su estudio posterior, especialmente útil en casos de amplificación de PCR.
• Realizar manchas en tela de algodón estéril o papel filtro con 500microlitros de sangre fresca.
• Cortar un pedazo de tela de 3 mm de diámetro y colocarla en un tubo de 15ml, de ser varias manchas, utilizar una hoja de bisturí nueva por cada una o una tijera esterilizada luego de cada corte para evitar contaminación.
• Colocar 1mL de agua estéril desionizada.
• Incubar a temperatura ambiente entre 15 y 30°C, por aproximadamente 20 minutos. Mezclar ocasionalmente por inversión. A su vez hervir más agua.
• Spin en microcentrifuga por 3 minutos a 12500 rpm.
• Desechar el sobrenadante.
• Añadir 130 microlitros de Chelex al 5% (Chelex-100 Resin, BioRad).
• Mezclar con la ayuda de vórtex a la mayor velocidad por 10 segundos.
• Con una aguja incandescente hacer un pequeño agujero a los tubos para que el contenido no ebulla por el calor o salte.
• Colocar los tubos en agua hirviendo por 8 minutos, es preferible usar tubos con rosca para que el contenido no se abra ni se contamine.
• Mezclar en vórtex a alta velocidad por 10 segundos.
• Centrifugar por 3 minutos a 12500 rpm.
• Almacenar a 4°C.
• Antes de usar las muestras almacenadas se debe centrifugar por 3 minutos a 12500 rpm.
Extracción de ADN en pelo con bulbo con resina quelante.chelex 100
• Utilizar un escalpelo limpio y cortar una porción de 5-10 mm de raíz del pelo.
• Añadir framento de pelo 200mcl de Chelex al 5% en un tubo de 1.5mL.
• Incubar toda la noche a 56°C, tiempo minimo 8 horas.
• Mezclar en un voprtex a alta velocidad por 10 seg.
• Poner en agua hirviendo durante 8 min.
• Mezclar con vórtex a alta velocidad por 10 segundos.
• Centrifugar por 3 minutos a 12500 rpm.
• Añadir 40 mcl de sobrenadante a la mezcla de la PCR.
No hay que olvidar que los pelos con raíz (bulbo= arrancados, frescos, son los mejores para obtener ADN de alto peso molecular en gandes cantidades).
Extracción de ADN de pelo sin bulbo usando resina quelante Chelex-100.
• Utilizar un escalpelo limpio ycortar una porción de 2 a 3 cm de pelo.
• Añadir framento de pelo a 200 mcl de Chelex al 5% en un tubo de microcentrifuga de 1.5ml.
• Incubar 56°C durante 30 min a una hora.
• Mezclar en un vórtex a alta velocidad por 5 a 10 min.
• Spín en una microcentrifuga durante 10-20 seg a 12500 rpm.
• Colocar en agua hirviendo durante 8 min.
• Mezclar en un vortex a alta velocidad por 5-10 seg.
• Centrifugar por 3 min a 12500 rpm.
• Añadir 20 mcl de sobrenadante a la mezcla de PCR.
Una muestra se introduce en un tubo de Eppendorf y se mezcla en 500 μl de una solución de resina Chelex-100 al 10%. Esta se prepara previamente disolviendo la resina a la proporción reseñada en agua ésteril desionizada a 60°C y removiéndola. Se añade a la solución 15 μl de proteinasa K (Boehringer Mannheim) a una proporción de 10 mg/ml, incubando la mezcla a 55ºC en agitación continua durante una hora. A continuación, la mezcla se introduce durante
15 minutos a 100ºC para intensificar la desnaturalización de las proteínas. Los tubos que contienen el ADN extraído y la resina Chelex en unión con las proteínas degradadas se almacenan a 4ºC o –20ºC. Antes de utilizarlo se agita en un vórtex y se centrifuga a 10.000 rpm durante 10 segundos para depositar la masa que forman la resina y las proteínas.
Posteriormente, se vuelve a centrifugar el tubo durante 10 minutos para diferenciar la porción superficial en la que se encontrará el ADN y la inferior que incluye a la resina Chelex-100, las proteínas desnaturalizadas y otros elementos.
Para la utilización en la PCR, se toman 2 μl del sobrenadante por cada 10 μl de volumen final de la mezcla para la PCR.
Este método utiliza el mismo protocolo, pero no se añade la proteinasa K en la mezcla de tejido y resina Chelex-100
Extracción ADN: El tamaño de los tejidos es de secciones de 5mcm (priomedio de volumen recogido de 1.44ml) y el tamaño de las muestras de bipsias en secciones de 1’ mcm (promedio de volumen 0.034 ml), fueron cortadas y procesadas de acuerdo a los siguientes métodos.
Método 1.
-100mcl muestra tamaño normal y 50mcl de muestra de biopsia.
-Resusopendido en solución de resina Chelex-100 al 5%.
-Ebullición por 20 minutos.
Método 2.
-Con pretratamiento.
-100 mcl muestra tamaño normal y 50 mcl de muestra de biopsia.
-Resuspendidas en 100 mcl solución tampón que contiene 200 mcg/ml de Proteinasa K (50mM de KCl, 1.5mM MgCl2, 10mM TRIS-HCL, 0.5% Tween 20- pH 9 a 25°C).
-Adicionar Solución de Chelex-100 al 5 %.
-La mezcla es llevada a ebullición por 8 minutos.
-Después de la ebullición, todos los tubos se refrigeran con hielo, se centrifuga durante 5 minutos a 18000 rpm x g.
-Es usada como cadena de molde de ADN una alícuota de 5mcl de sobrenadante (10 mcl para la muestra de biopsia de tejidos).
El efecto de Chelex impide la degradación del ADN, al parecer por los iones metálicos que pueden acturar como catalizadores en la ruptura del ADN a altas temperaturas sin dejar de baja fuerza iónica.
Las plantillas con Chelex son mejores conservadas.
7. Explique por qué razón el DNA extraído con Chelex no es visto cuando es llevado a electroforesis en agarosa o poliacrilamida.
No se revela con gel de agarosa por la poca interacción con el bromuro de etidio (Marcadores de la electroforesis: Para la visualización de los ácidos nucleicos se utiliza un colorante fluorescente, el bromuro de etidio. Este colorante tiene la propiedad de intercalarse entre las bases nitrogenadas del ADN).
10 ng de carril de concentración de DNA no se ve. Poco DNA tendrá mucha calidad.
25-500 pares de bases es lo que lee agarosa.
DNA 100 pares de bases no se puede leer.
9. Explique cuál es la importancia de cuantificar el DNA extraído de un indicio biológico.
10. Cuáles son las consideraciones idóneas que una técnica de extracción debiera presentar.
La técnica debe poseer un buen porcentaje de recobro de la muestra.
Tener un menor número de pasos donde se pueda perder o degradar la muestra.
Cuantificar el ADN de la muestra
1. Son marcadores moleculares caracterizados por ser bialélicos y que se denominan de un sólo nucleótido:
a) RFLPs
b) VNTRs
c) SNPs
d) STRs
e) Ninguno de los anteriores
f) Todos los anteriores
2. Son los marcadores moleculares que requieren del empleo de enzimas de restricción:
a) RFLPs
b) VNTRs
c) SNPs
d) STRs
e) Ninguno de los anteriores
f) Todos los anteriores
3. Son marcadores moleculares caracterizados por encontrarse en sucesiones repetidas (tándem) de 2 a 7 nucleótidos
a) RFLPs
b) VNTRs
c) SNPs
d) STRs
e) Ninguno de los anteriores
f) Todos los anteriores
4. Son los marcadores más adecuados cuando se trata de muestras muy degradadas:
a) RFLPs
b) VNTRs
c) SNPs
d) STRs
e) Ninguno de los anteriores
f) Todos los anteriores
En los últimos tiempos, se ha incorporado a la Genética Forense una técnica complementaria a los STRs, los llamados marcadores SNPs (Single Nucleotid Polimorphisme), que permiten obtener ADN de muestras muy degradadas o muy pequeñas ─es posible incluso extraer el ADN de algunas huellas dactilares latentes─, e incrementan las posibilidades informativas ─estudio del origen geográfico, por ejemplo. En la actualidad, los STRs siguen siendo los marcadores más empleados, y los SNPs se utilizan, ante todo, para muestras muy degradadas.
5. Su empleo puede aplicarse al DNA nuclear:
a) RFLPs
b) VNTRs
c) SNPs
d) STRs
e) Ninguno de los anteriores
f) Todos los anteriores
ForenseRFLPs
•Enzimas de restricción reconocen secuencias de DNA específico.
•Cualquier cambio en la secuencia del DNA crea o elimina sitios de restricción particulares.
•Alterando el tamaño de uno o más fragmentos del DNA (Southern blot).
•Población no tienen los mismos sitios de restricción
6. Para qué sirven y cuáles son las características que hacen a las tarjetas FTA uno de los materiales de mayor uso en los laboratorios de Genética Forense.
Es una herramienta revolucionaria para simplificar la recolección, archivado, purificación y análisis de DNA y RNA obtenidos de un amplio surtido de fuentes biológicas, tales como sangre total, raspados bucales, materiales de planta, plásmicos, tejido y microorganismos.
Ventajas: No hay fractura de DNA, purificación simple, fácil almacenamiento.
Duración de la muestra: Hasta -81°C seis meses. Temperatura ambiente y humedad de 6 meses sin protección. Temperatura ambiente y humedad 11 años con protección.
Aplicación: Aislamiento de ADN Genómico; aislamiento de ADN mitocondrial, aislamiento de ADN proviral.
8. Explica con detalle en qué consiste y cómo se realiza una extracción con Chelex.
El Chelex es un compuesto de copolimeros de estireno divinilbenceno, que contiene iones inminodiacetato apareados, los cuales actúan como quelantes, agrupando los iones metálicos polivalentes como el magnesio, agrupando los iones metálicos polivalentes como el magnesio. El retido de magnesio en la reacción inhibe a las enzmas , muy útil en ciencia forense, porque en concentraciones de 5 al 10% de Cheles-100 es capaz de depurar suficientemente la gran mayoría de las muestras, dejándolas aptas para su estudio posterior, especialmente útil en casos de amplificación de PCR.
• Realizar manchas en tela de algodón estéril o papel filtro con 500microlitros de sangre fresca.
• Cortar un pedazo de tela de 3 mm de diámetro y colocarla en un tubo de 15ml, de ser varias manchas, utilizar una hoja de bisturí nueva por cada una o una tijera esterilizada luego de cada corte para evitar contaminación.
• Colocar 1mL de agua estéril desionizada.
• Incubar a temperatura ambiente entre 15 y 30°C, por aproximadamente 20 minutos. Mezclar ocasionalmente por inversión. A su vez hervir más agua.
• Spin en microcentrifuga por 3 minutos a 12500 rpm.
• Desechar el sobrenadante.
• Añadir 130 microlitros de Chelex al 5% (Chelex-100 Resin, BioRad).
• Mezclar con la ayuda de vórtex a la mayor velocidad por 10 segundos.
• Con una aguja incandescente hacer un pequeño agujero a los tubos para que el contenido no ebulla por el calor o salte.
• Colocar los tubos en agua hirviendo por 8 minutos, es preferible usar tubos con rosca para que el contenido no se abra ni se contamine.
• Mezclar en vórtex a alta velocidad por 10 segundos.
• Centrifugar por 3 minutos a 12500 rpm.
• Almacenar a 4°C.
• Antes de usar las muestras almacenadas se debe centrifugar por 3 minutos a 12500 rpm.
Extracción de ADN en pelo con bulbo con resina quelante.chelex 100
• Utilizar un escalpelo limpio y cortar una porción de 5-10 mm de raíz del pelo.
• Añadir framento de pelo 200mcl de Chelex al 5% en un tubo de 1.5mL.
• Incubar toda la noche a 56°C, tiempo minimo 8 horas.
• Mezclar en un voprtex a alta velocidad por 10 seg.
• Poner en agua hirviendo durante 8 min.
• Mezclar con vórtex a alta velocidad por 10 segundos.
• Centrifugar por 3 minutos a 12500 rpm.
• Añadir 40 mcl de sobrenadante a la mezcla de la PCR.
No hay que olvidar que los pelos con raíz (bulbo= arrancados, frescos, son los mejores para obtener ADN de alto peso molecular en gandes cantidades).
Extracción de ADN de pelo sin bulbo usando resina quelante Chelex-100.
• Utilizar un escalpelo limpio ycortar una porción de 2 a 3 cm de pelo.
• Añadir framento de pelo a 200 mcl de Chelex al 5% en un tubo de microcentrifuga de 1.5ml.
• Incubar 56°C durante 30 min a una hora.
• Mezclar en un vórtex a alta velocidad por 5 a 10 min.
• Spín en una microcentrifuga durante 10-20 seg a 12500 rpm.
• Colocar en agua hirviendo durante 8 min.
• Mezclar en un vortex a alta velocidad por 5-10 seg.
• Centrifugar por 3 min a 12500 rpm.
• Añadir 20 mcl de sobrenadante a la mezcla de PCR.
Una muestra se introduce en un tubo de Eppendorf y se mezcla en 500 μl de una solución de resina Chelex-100 al 10%. Esta se prepara previamente disolviendo la resina a la proporción reseñada en agua ésteril desionizada a 60°C y removiéndola. Se añade a la solución 15 μl de proteinasa K (Boehringer Mannheim) a una proporción de 10 mg/ml, incubando la mezcla a 55ºC en agitación continua durante una hora. A continuación, la mezcla se introduce durante
15 minutos a 100ºC para intensificar la desnaturalización de las proteínas. Los tubos que contienen el ADN extraído y la resina Chelex en unión con las proteínas degradadas se almacenan a 4ºC o –20ºC. Antes de utilizarlo se agita en un vórtex y se centrifuga a 10.000 rpm durante 10 segundos para depositar la masa que forman la resina y las proteínas.
Posteriormente, se vuelve a centrifugar el tubo durante 10 minutos para diferenciar la porción superficial en la que se encontrará el ADN y la inferior que incluye a la resina Chelex-100, las proteínas desnaturalizadas y otros elementos.
Para la utilización en la PCR, se toman 2 μl del sobrenadante por cada 10 μl de volumen final de la mezcla para la PCR.
Este método utiliza el mismo protocolo, pero no se añade la proteinasa K en la mezcla de tejido y resina Chelex-100
Extracción ADN: El tamaño de los tejidos es de secciones de 5mcm (priomedio de volumen recogido de 1.44ml) y el tamaño de las muestras de bipsias en secciones de 1’ mcm (promedio de volumen 0.034 ml), fueron cortadas y procesadas de acuerdo a los siguientes métodos.
Método 1.
-100mcl muestra tamaño normal y 50mcl de muestra de biopsia.
-Resusopendido en solución de resina Chelex-100 al 5%.
-Ebullición por 20 minutos.
Método 2.
-Con pretratamiento.
-100 mcl muestra tamaño normal y 50 mcl de muestra de biopsia.
-Resuspendidas en 100 mcl solución tampón que contiene 200 mcg/ml de Proteinasa K (50mM de KCl, 1.5mM MgCl2, 10mM TRIS-HCL, 0.5% Tween 20- pH 9 a 25°C).
-Adicionar Solución de Chelex-100 al 5 %.
-La mezcla es llevada a ebullición por 8 minutos.
-Después de la ebullición, todos los tubos se refrigeran con hielo, se centrifuga durante 5 minutos a 18000 rpm x g.
-Es usada como cadena de molde de ADN una alícuota de 5mcl de sobrenadante (10 mcl para la muestra de biopsia de tejidos).
El efecto de Chelex impide la degradación del ADN, al parecer por los iones metálicos que pueden acturar como catalizadores en la ruptura del ADN a altas temperaturas sin dejar de baja fuerza iónica.
Las plantillas con Chelex son mejores conservadas.
7. Explique por qué razón el DNA extraído con Chelex no es visto cuando es llevado a electroforesis en agarosa o poliacrilamida.
No se revela con gel de agarosa por la poca interacción con el bromuro de etidio (Marcadores de la electroforesis: Para la visualización de los ácidos nucleicos se utiliza un colorante fluorescente, el bromuro de etidio. Este colorante tiene la propiedad de intercalarse entre las bases nitrogenadas del ADN).
10 ng de carril de concentración de DNA no se ve. Poco DNA tendrá mucha calidad.
25-500 pares de bases es lo que lee agarosa.
DNA 100 pares de bases no se puede leer.
9. Explique cuál es la importancia de cuantificar el DNA extraído de un indicio biológico.
10. Cuáles son las consideraciones idóneas que una técnica de extracción debiera presentar.
La técnica debe poseer un buen porcentaje de recobro de la muestra.
Tener un menor número de pasos donde se pueda perder o degradar la muestra.
Cuantificar el ADN de la muestra
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